基本原理：

本试剂盒利用抗体和R-PE上游离的氨基，采用定向对接偶联技术将抗体分子与R-PE共价偶联，本试剂盒采用加长臂方案，使被标记抗体与荧光蛋白之间有一定长度柔性连接臂，避免由于位阻妨碍抗体活性或者荧光蛋白发光效率。

主要特点：

ü  试剂盒组分齐全，操作简单，只要按照操作步骤进行便可得到高品质R-PE偶联抗体；

ü  本试剂盒所配置的R-PE为高纯度，高活性荧光蛋白，荧光发光效率更高；

ü  本试剂采用定向偶联技术，荧光蛋白和抗体都不会发生自连，保证偶联物的特异性和均一性；

ü  试剂盒所使用的交联剂增加了延长臂，确保不会因为蛋白质位阻而影响发光效率；

ü  鉴于R-PE的蛋白骨架特性，其抗淬灭能力更强。

试剂盒已经提供材料：

ü  R-PE蛋白冻干粉      1mg*1支  可用于标记300-500ug抗体

ü  R-PE蛋白活化试剂    2mg*1支  使用前加ddH2O 200ul

ü  修饰反应液        30ml*1瓶

ü  标记缓冲液        30ml*1瓶

ü  抗体修饰试剂干粉    2mg*1支 使用前加1000ul ddH2O

ü  30KMWCO超滤管      3支

ü  封闭试剂         1支 使用前加DMSO 5ul

ü  DMSO溶剂         200ul*1支

ü  说明书          1份

其他需要自备试剂材料：

²  待标记的生物分子；

²  移液器及吸头；

²  去离子水。

试剂盒储存

试剂盒抗体修饰试剂、R-PE蛋白活化试剂和封闭试剂，放在-20˚C，其余组分放在2-8℃可保存6个月以上。

试剂盒操作流程：

1a.抗体的修饰 与1b.R-PE的活化两个步骤同时进行

1a.抗体的修饰

1）抗体修饰试剂干粉溶解于ddH2O配制成2mg/ml的抗体修饰试剂液。

2）取待标记抗体（纯度>90%），用修饰反应液调整浓度到 5mg/ml左右，按照每mg抗体加入5μl抗体修饰试剂液，轻轻混匀，在室温下搅拌反应 60-90分钟。

3）反应完成后，转移到超滤管内芯，并添加标记缓冲液，通过超滤管多次离心置换溶液去除多余抗体修饰试剂，超滤管内芯收集液为修饰抗体，并调节浓度至 3mg/ml。

1b.R-PE蛋白的活化

1）取1支R-PE蛋白冻干粉用标记缓冲液重悬到5mg/ml浓度R-PE蛋白溶液；

2）将R-PE蛋白活化试剂溶解于ddH2O，配制成5mg/ml R-PE蛋白活化试剂溶液，按照每mg R-PE蛋白加入100ul的比例加入到R-PE蛋白溶液，室温避光反应2小时；

3）反应完毕，转移到超滤管内芯，通过超滤管离心4次，每次120，00rpm 5min,置换为标记缓冲液,以去除游离的R-PE蛋白活化试剂，滤芯内溶液即为活化R-PE蛋白。

2.活化R-PE蛋白与抗体偶联

1）活化R-PE蛋白浓度调整为5mg/ml；

2）将修饰抗体与活化R-PE蛋白，按照质量比1:3比例（每mg修饰抗体对应3mg活化R-PE蛋白）混合，室温避光反应2小时；

3）将封闭试剂管中加入5ul DMSO配成封闭试剂液，按照每0.5mg抗体5ul的体积封闭试剂液加入步骤2）反应产物中，封闭未反应完的活性基团；

4）将步骤3)溶液加入超滤管通过反复离心置换标记缓冲液，去除封闭试剂等；

5）标记好的抗体分装，加入适当保护剂，-20℃保存备用。