一、产品介绍

1．产品背景

Fluor荧光染料为活性荧光染料，该系列包括从紫外、可见光谱到近红外光谱常见荧光染料，用于标记生物分子，特别是蛋白质和核酸。对核心结构的创新性修改使得 Fluor染料优于具有许多创新新颖特征的其他商业染料，主要表现在标记效率更高，发光度更强。

Fluor594是一种荧光染料，其激发波长和发射波长分别为587nm和603nm，它与抗体形成更特异的抗体荧光素结合物，背景较更低。

2．基本原理

本试剂盒主要通过荧光素集团的活性键与生物分子的游离氨基共价结合，可以用于标记抗体，蛋白，多肽或者核酸。本试剂盒种所提供的荧光染料都为预先活化，可以直接用于标记实验。标记产物可以放置在 4˚C至少保存6个月以上。

本试剂盒常常被用于一抗的直接标记，主要优点是省却了二抗的使用和其所带来的操作步骤。

二、主要信息

1．试剂盒已经提供的材料：

活化的 Fluor594溶液: 已活化，可直接用于标记      1支.

Fluor594标记缓冲液: 优化最适标记反应.            1 支.

纯化超滤管:                                         1支.

注意：试剂盒中所配超滤管标示的截留分子量必须小于待标记分子分子量2倍以上

本试剂盒主要有以下几种规格：

· 100 µg (1 x 100 µg), 可以用于50µg-150µg抗体标记1次，最佳标记量为100µg。

· 300 µg (300 µg), 可以用于150µg-450µg抗体标记1次，每次最佳标记量为450µg。

· 1mg (1 x 1mg), 可以用于500µg-1500µg抗体标记1次，每次最佳标记量为1000µg。

2．其他需要自备材料：

• 待标记的生物分子

• 移液器及吸头.

• 去离子水.

• PBS (pH 7.4)

3．试剂盒储存

试剂盒放在-20˚C可保存6个月以上。.

三、试剂盒使用操作流程

1．试剂准备

待标记的生物分子与荧光素最佳摩尔比例为1:8-1:22,本试剂盒推荐最佳比例为1:15； 为了获得最佳的摩尔比例，可以要通过预实验进行摸索。以抗体标记为例，推荐量如下。最佳标记体系应保证抗体的浓度为2mg/ml，标记时终浓度不低于1mg/ml。对于其他标记量，参照表按等比例调整抗体的体积和用量。

2．样品准备

待标记的分子浓度不低于2 mg/ml，如果浓度较低，需在实验之前浓缩到2mg/ml以上；待标记的分子需要溶解在符合以下要求的缓冲液中，如果符合以下要求可以直接进行标记，如果不符合请将溶液置换（透析或者超滤）到符合要求的溶液中在进行标记实验。

溶液中一定不能含有游离氨基，否则会影响标记效率。

3．操作流程(以标记100ug抗体为例,2mg/ml)

1). 取5 µl Fluor594标记缓冲液，加入到上述准备好的待标记抗体溶液中，用移液器轻轻混匀

2). 打开活化的 Fluor594溶液盖子，取2.5 µl加入到步骤1的溶液中，去离子水补足到50 µl，轻轻混匀，37°C 避光反应1小时。

3). 反应完毕，将适量的PBS（约450u L）加入到步骤2的混合溶液中，轻轻混匀并将溶液移至超滤管，4°C 12000离心10min。

4) .将超滤管芯内溶液轻轻混匀并吹打管心内壁，并转移到一干净离心管中即为荧光素标记产物。

4．标记产物的保存

根据实验需要调整到合适的浓度，可加入适量BSA，甘油及防腐剂等，分装成小分-20°C避光保存。

四、技术支持

常见问题及解决办法

Q: 待标记分子经过浓缩浓度仍然达不到2 mg/ml，再浓缩就产生沉淀了怎么办?

A: 标记的时候尽可能达到这个浓度，如果实在达不到这个浓度，步骤2不需要再补足去离子水，适当增加加入的活化的荧光素的量；最佳标记效果可以梯度增加荧光素用量试验测试来确定。

Q: 待标记分子与荧光素的最佳摩尔比只能是1:8 - 1:22之间？

A: 这个要根据不同生物分子性质确定，更准确的说与生物分子表面氨基个数有关系；最佳标记比例可根据梯度用量测试确定。

Q: 如果选择标记试剂盒中的超滤管型号?

A: 一般来说，您待标记生物分子的分子量是超滤管截留分子量的2倍以上最好；比如，标记抗体，抗体分子量为150Kd,选择分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超滤越慢。如果分子量太小，标记完以后建议用更高精度的纯化方式，比如，10kD分子量建议用HPLC纯化