Exonuclease III 是一种核酸外切酶，该酶作用于双链 DNA，从 3'OH 末端方向逐步切去单核苷酸。该酶最适 底物是平末端或 5'末端突出的 DNA，但也可以作用于双链 DNA 切刻位点产生单链缺口。由于对单链 DNA 无 活性，因此该酶难以切割 3'突出末端。3'到 5'外切酶活性对底物的消化程度随 3'突出末端的长度而变化，四碱 基或更长的突出末端难以被切割。这种特性可以用于生产特定方向的单链 DNA，将线性化 DNA 设计成为一端 为不切割末端（3'突出端），另一端则设计为易切割末端（平端或 5'突出端），此时 Exonuclease III 将仅消化一 条链。

Exonuclease III 的活性部分依赖 DNA 双螺旋结构，并根据序列的不同而有差异（C＞A=T＞G）。此外，该酶也 有 RNase H、3’-磷酸酶、脱嘌呤/嘧啶（AP）位点特异性核酸内切酶活性。

（1）单向嵌套缺失；

（2）定点突变；

（3）单链特异性探针的制备；

（4）双脱氧测序用单链底物的制备。